Conform definiției fizicianului englez Rayleigh, rezoluția unui sistem optic este distanta minima dintre doua puncte imaginea pe care o creează, în timp ce acestea sunt încă vizibile separat. Rayleigh a arătat că rezoluția maximă a unei lentile (adică distanța minimă dîntre două puncte de imagine adiacente) este direct proporţională cu lungimea undei luminoase utilizate lși invers proporțională cu indicele de refracție al mediului n, precum și unghiul de deschidere A:

Lungime de undă l egal cu produsul vitezei luminii v pentru perioada de oscilație T. Indicele de refracție n definită ca raportul dintre viteza luminii în vid (300.000 km/sec) și viteza luminii vîn acest mediu. Pentru aer, indicele de refracție este de 1,0, pentru apă - 1,3, pentru ulei de cedru - 1,5. Unghi de deschidere A caracterizează capacitatea unei lentile de a colecta razele de lumină. Este definit ca unghiul dintre cele două linii care leagă marginea lentilei de punctul focalizat frontal și, prin urmare, depinde de diametrul lentilei și de curbura acesteia (Fig. 3). Valoare maximă A pentru lentilele moderne ajunge la 138 o.

Orez. 3. Deschiderea obiectivului a

De asemenea, din formula Rayleigh rezultă că rezoluția unui microscop poate fi mărită în trei moduri:

1) o scădere a lungimii de undă l(această metodă este implementată în microscoape ultraviolete și electronice);

2) o creștere a indicelui de refracție al mediului n(lentile de imersie);

3) o creștere a diametrului lentilelor obiectiv (adică o creștere a unghiului A).

Pentru a facilita compararea rezoluției diferitelor lentile, Abbe a separat numitorul formulei Rayleigh într-un indicator separat - deschiderea numerică N / A, după care formula a luat următoarea formă:

Diafragma numerică a obiectivului NA = n * sin(a/2)își caracterizează rezoluția, indiferent de designul și lungimea de undă utilizate. Introducerea unui factor de mediere de 0,61 reflectă faptul că rezoluția maximă este asigurată doar de razele de margine cu unghiul maxim. A, în timp ce razele apropiate de centrală dau o rezoluție de două ori mai mică (Fig. 3). NA lentilelor de aer este întotdeauna mai mică de 1
(n = 1, păcat a < 1), но иммерсионные объективы могут иметь NA и больше 1. Величина численной апертуры объектива гравируется на его корпусе, что позволяет легко вычислить его номинальное разрешение, используя формулу Рэлея-Аббе. В этих расчетах обычно принимают, что средняя длина волны дневного света составляет 550 нм. Численная апертура современных иммерсионных объективов достигает значений 1.3 – 1.4. Рекорд в этой области принадлежит объективу фирмы Карл Цейсс с апертурой 1.45, который способен формировать изображения микроструктур размером 170 нм.

Pe lângă rezoluția în planul de pregătire d(rezoluție câmp), obiectivul microscopului are și rezoluție de adâncime dz(Tânăr, 1998).

Rezoluția în adâncime (adâncimea de focalizare) joacă un rol special în microscopia confocală, unde reconstrucțiile tridimensionale ale microstructurilor sunt create pe baza secțiunilor optice și unde grosimea secțiunii optice afectează puternic calitatea reconstrucției. Prin urmare, microscoapele confocale sunt furnizate hardware și software special pentru a reduce adâncimea focalizării. După cum rezultă din formula Young pentru un microscop convențional, adâncimea focalizării este dz aproape nu diferă de rezoluția câmpului d.

Al doilea cel mai important indicator al lentilelor și al ocularelor este mărirea, care este întotdeauna indicată pe ramele acestora. Ca regulă generală, cu cât mărirea unui obiectiv este mai mare, cu atât deschiderea sa numerică (adică rezoluția) este mai mare. Cu toate acestea, această dependență nu este întotdeauna observată - există lentile cu aceeași mărire cu deschideri diferite și chiar reglabile, iar lentilele cu o deschidere mare pot avea o mărire redusă. În acest sens, distingeți utilși spor inutil, ceea ce înseamnă că mărirea utilă este legată de rezoluție, iar mărirea inutilă nu este. Mărirea în esență inutilă este scalarea imaginii, în care cantitatea de informații primite rămâne aceeași sau chiar scade. Cu toate acestea, poate fi necesar, de exemplu, atunci când se potrivește dimensiunea câmpului vizual al unui microscop și matricea CCD a unei camere digitale.

Mărirea totală a unui microscop este egală cu produsul măririi obiectivului și a ocularului. În unele microscoape, trebuie luată în considerare și mărirea lentilelor suplimentare încorporate în atașamentul binocular. La microscoapele echipate cu camere de televiziune sau camere digitale, zoom-ului optic se adaugă un zoom electronic. Deoarece mărirea generală a microscopului în acest caz va depinde de mulți factori, se obișnuiește în publicațiile științifice să se indice marca microscopului, precum și mărirea și deschiderea obiectivului utilizat (de exemplu, Zeiss Axiolab, x100/). 1.25).

Calibrarea microscopului . Dacă se urmărește măsurarea dimensiunii celulelor și a altor microstructuri, microscopul trebuie calibrat. Microscopul este calibrat folosind un preparat special - un obiect-micrometru. Este o lamă de sticlă, în centrul căreia se află o scară cu diviziuni de 10 µm (Fig. 4). Există, de asemenea, micrometre-obiect sub forma unei plăci de metal cu o gaură în centru, unde sticla este fixată cu o scară de lumină pe un fundal întunecat. Cu toate acestea, sunt mai puțin convenabile din cauza dificultății de focalizare pe scară, mai ales atunci când există o lipsă de lumină la măriri mari.

Pentru a determina dimensiunea micro-obiectelor, o specială ocular de măsurare (ocular-micrometru), care are și o scară. Principiul calibrării este de a determina valoarea diviziunii scalei ocular-micrometru prin combinarea acesteia cu scara
obiect micrometru. Cunoscând valoarea diviziunii obiectului-micrometru și a numărului de diviziuni ale acestuia la un anumit număr de diviziuni ale ocularului-micrometru, este posibil, împărțind primul la al doilea, să se obțină factor de calibrare. Înmulțirea factorului de calibrare cu rezultatele măsurătorii
ocular-micrometru vă va permite să le aduceți la valoarea absolută, exprimată în micrometri. Pentru a îmbunătăți acuratețea măsurătorilor, se folosesc și micrometre îmbunătățite pentru ocular, care sunt echipate cu un șurub micrometru care mișcă indicatorul în câmpul vizual.

Dacă microscopul are o cameră încorporată sau o cameră digitală, calibrarea acestuia se efectuează după cum urmează:

1. Instalați obiectul-micrometru în microscop în așa fel încât diviziunile acestuia să ocupe o poziție strict verticală.

2. Focalizați lentila pe scara micrometrului obiect și faceți-i fotografia digitală (Fig. 4).

3. Folosind programul de procesare a imaginii Scion Image (sau similar), se obține un profil de luminozitate strict orizontal de-a lungul scalei.

4. Numărul de pixeli (elementele raster) este măsurat într-un segment care conectează două diviziuni de scară care sunt suficient de îndepărtate una de cealaltă.

5. Calculați factorul de calibrare împărțind lungimea segmentului (µm) la numărul de pixeli măsurați în acesta.

Orez. 4. Scara obiect-micrometru (stânga) și profilul său de luminozitate (dreapta).

Obiectiv x10, valoarea diviziunii 10 microni. Scara arată în plus linia profilului de luminozitate. Distanța dintre diviziunile extreme de-a lungul acestei linii este de 400 µm sau 265 pixeli. Factorul de calibrare este 1,509 (400/265).

Această metodă de calibrare a microscopului este rapidă și foarte precisă (eroare mai mică de 1%). Desigur, calibrarea trebuie făcută pentru fiecare lentilă separat, chiar dacă au aceeași mărire nominală.

Măsurarea rezoluției unui microscop. Formula Rayleigh-Abbe vă permite să calculați doar rezoluția nominală (adică teoretic așteptată) a lentilei. Rezoluția reală a lentilei (și a microscopului în ansamblu) poate diferi semnificativ de cea nominală.

Dacă microscopul este echipat cu o cameră TV sau o cameră digitală, măsurarea rezoluției sale efective nu este o mare problemă. Pentru a face acest lucru, totuși, este necesar să se ia în considerare mai detaliat principiul funcționării sale.

Difracția Fresnel descrisă mai sus sub formă de inele circulare concentrice (Fig. 1) are loc numai dacă unda luminoasă are coerență completă. Un sistem de iluminare al microscopului parțial coerent va forma un model de difracție fără inele pronunțate. Mai mult, din cauza imperfecțiunii opticii, transformata Fourier inversă va oferi și o imagine netezită în comparație cu cea originală. În consecință, microscopul introduce o eroare în procesul de imagistică, ceea ce duce la o scădere a rezoluției acestuia. Pentru a evalua această eroare la microscopie, funcția de împrăștiere a punctelor (P unt S pread F uniune, PSF) și funcția de transmisie optică (O optic T transfer F uniune, OTF).

Orez. 5. Funcția de împrăștiere a punctelor ( PSF) și funcția de transmisie optică ( OTF). OTF este transformata Fourier a PSF.

În esență, PSF este imaginea microscopică a unei găuri circulare de diametru minim, care este iluminată de lumină incoerentă, iar OTF este transformata sa Fourier (Fig. 5). Cu cât este mai mic PSF (și cu cât este mai mare OTF asociat cu acesta), cu atât rezoluția este mai mare. Astfel, sarcina de a măsura rezoluția unui microscop se reduce la determinarea PSF (sau OTF) a acestuia.

Există multe moduri diferite de a estima direct și indirect valoarea PSF. De exemplu, poate fi calculat prin examinarea formei scăderilor de luminozitate în vecinătatea limitelor microobiectelor. În practică, totuși, cel mai simplu și mai precis mod de a estima rezoluția maximă a unui microscop este de a analiza OTF-ul său, mai degrabă decât PSF-ul său.

Pentru a măsura rezoluția unui microscop la o anumită mărire OTF, trebuie să:

1. Obțineți o fotografie digitală a unui preparat citologic.

2. Pentru a putea aplica algoritmul de transformare Fourier rapidă, tăiați o secțiune pătrată din el, a cărei latură L(în pixeli) este o putere de 2 (128.256.512 etc.).

3. Efectuați o transformare Fourier directă a acestei secțiuni folosind programul Scion Image (sau similar) și obțineți OTF-ul microscopului.

4. Măsurați diametrul OTF ( D)în pixeli (Fig. 5).

5. Folosind parametrii obținuți Lși D, precum și dimensiunile celulelor matricei camerei Cîn µm, mărirea adaptorului camerei Mași mărirea lentilelor lu,calculați rezoluția maximă a microscopului dîn nm după formula:

Orez. 6. Imaginea anafazată a mitozei (256x256) și imaginea lui Fourier.

O fotografie digitală a unei celule rădăcină de ceapă care se împarte prin mitoză (Fig. 6, stânga) a fost realizată folosind un microscop Zeiss Axiolab, lentilă x100/1,25, cameră Axiocam MR cu adaptor x0,63, dimensiunea celulei cu matrice CCD 6,7 µm (specificată în caietul de sarcini). Imaginea Fourier a acestei imagini (Fig. 6, dreapta) a fost obținută în programul Scion Image după tăierea cu un cadru de 256x256. Diametrul OTF măsurat folosind programul Scion Image este de 129 pixeli, iar rezoluția microscopului calculată folosind formula de mai sus este de 211 nm.

Precizia acestei metode de măsurare a rezoluției microscopului depinde în principal de determinarea corectă a diametrului OTF. Cu toate acestea, după cum se poate observa din profilul de luminozitate OTF (Fig. 7), limita sa scade treptat până la nivelul de zgomot aleatoriu, ceea ce face dificilă măsurarea D.

O modalitate de a îmbunătăți obiectivitatea determinării diametrului unui OTF este măsurarea acestuia (sau a razei OTF, care este notat ca HWHM) la jumătate din luminozitatea maximă a semnalului. În acest caz, estimarea rezoluției microscopului va fi oarecum mai mică decât valoarea maximă.

O altă modalitate este de a folosi preparate speciale preparate din diatomee și care conțin mici structuri regulate la limita rezoluției microscopului. În acest caz, în imaginea Fourier apar reflexii contrastante, care facilitează foarte mult măsurarea precisă a diametrului OTF.

Orez. 7. Profil de luminozitate OTF de la centru la periferie. HWHM- raza OTF la nivelul de jumătate din maximul său ( H alfa W idth pe H alfa M maxim).

PSF și OTF sunt direct legate de formula Rayleigh-Abbe. Într-un microscop fără aberații, PSF are simetrie circulară și este dat de

Unde HR) este PSF J1 este funcția Bessel de primul fel, A = 2pNA/l.

Astfel, cel puțin în cazul ideal, forma PSF este determinată de doar doi parametri - lungimea de undă l și deschiderea numerică a obiectivului NA. Descrierea analitică a PSF poate fi utilizată pentru a crește rezoluția microscopului prin procesarea suplimentară a imaginii pe un computer.

Microscoapele sunt folosite pentru a detecta și studia microorganismele. Microscoapele ușoare sunt concepute pentru a studia microorganismele care au o dimensiune de cel puțin 0,2 microni (bacterii, protozoare etc.), iar microscoapele electronice pentru a studia microorganismele mai mici (virusurile) și cele mai mici structuri ale bacteriilor.
Modern microscoape ușoare- Sunt dispozitive optice complexe, a căror manipulare necesită anumite cunoștințe, abilități și o mare precizie.
Microscoapele ușoare sunt împărțite în studenți, de lucru, de laborator și de cercetare, diferă în design și optică. Microscoapele domestice (Biolam, Bimam, Mikmed) au denumiri care indică grupului din care aparțin (C - student, R - lucrători, L - laborator, I - cercetare), echipamentul este indicat printr-un număr.

Un microscop este împărțit în părți mecanice și optice.
La piesa mecanica includ: un trepied (format dintr-o bază și un suport pentru tub) și un tub montat pe acesta cu un revolver pentru montarea și schimbarea lentilelor, o masă de obiecte pentru pregătire, dispozitive pentru atașarea unui condensator și filtre de lumină, precum și mecanisme construite în trepied pentru grosier (macromecanism, macroșurub) și fin
(micromecanism, microșurub) pentru deplasarea etajului obiect sau suportului tubului.
Partea optică Microscopul este reprezentat de obiective, oculare și un sistem de iluminare, care constă la rândul său dintr-un condensator Abbe situat sub treapta obiect, o oglindă având latura plată și concavă, precum și un iluminator separat sau încorporat. Obiectivele sunt înșurubate în revolver, iar ocularul corespunzător, prin care se observă imaginea, este instalat pe partea opusă a tubului. Există tuburi monoculare (care au un ocular) și binoculare (care au două oculare identice).

Schema schematică a microscopului și a sistemului de iluminare

1. Sursa de lumina;
2. Colector;
3. Diafragma câmpului irisului;
4. Oglinda;
5. Diafragma de deschidere a irisului;
6. Condensator;
7. Medicament;
7". Imagine intermediară reală mărită a preparatului, formată; prin obiectiv;
7"". Imaginea finală virtuală mărită a preparatului, observată în ocular;
8. Lentila;
9. pictograma lentilei de ieșire;
10. Deschiderea câmpului ocularului;
11. Ocular;
12. Ochi.

Joacă un rol major în achiziția de imagini obiectiv. Construiește o imagine mărită, reală și inversată a obiectului. Apoi această imagine este mărită și mai mult atunci când este privită printr-un ocular, care, în mod similar cu o lupă convențională, oferă o imagine virtuală mărită.
Crește microscopul poate fi determinat aproximativ prin înmulțirea măririi obiectivului cu mărirea ocularului. Cu toate acestea, mărirea nu determină calitatea imaginii. Calitatea imaginii, claritatea acesteia, este determinată rezoluția microscopului, adică capacitatea de a distinge separat două puncte apropiate. Limită de rezoluție- distanta minima la care aceste puncte sunt inca vizibile separat - depinde de lungimea de unda a luminii care lumineaza obiectul si de deschiderea numerica a obiectivului. Apertura numerică, la rândul său, depinde de deschiderea unghiulară a obiectivului și de indicele de refracție al mediului dintre lentila frontală a obiectivului și preparat. Diafragma unghiulară este unghiul maxim la care razele care trec printr-un obiect pot pătrunde în lentilă. Cu cât deschiderea este mai mare și cu cât indicele de refracție al mediului dintre lentilă și preparat este mai aproape de indicele de refracție al sticlei, cu atât rezoluția lentilei este mai mare. Dacă luăm în considerare deschiderea condensatorului egală cu deschiderea obiectivului, atunci formula rezoluției are următoarea formă:

unde R este limita de rezoluție; - lungimea de unda; NA - deschidere numerică.

Distinge utilși inutil crește. Mărirea utilă este de obicei egală cu deschiderea numerică a obiectivului mărită de 500-1000 de ori. Mărirea oculară mai mare nu scoate la iveală detalii noi și este inutilă.
În funcție de mediul care se află între obiectiv și preparat, există lentile „uscate” de mărire mică și medie (până la 40x) și lentile de imersie cu deschidere și mărire maximă (90-100x). O lentilă „uscata” este o lentilă cu aer între lentila frontală și specimen.

O caracteristică a lentilelor de imersiune este că între lentila frontală a unui astfel de obiectiv și preparat este plasat un lichid de imersie, care are un indice de refracție la fel ca sticla (sau aproape de acesta), ceea ce asigură o creștere a deschiderii numerice și a rezoluției. a lentilei. Apa distilată este folosită ca lichid de imersie pentru lentilele de imersie în apă, iar uleiul de cedru sau un ulei sintetic special de imersie este utilizat pentru lentilele de imersie în ulei. Utilizarea uleiului sintetic de imersie este de preferat, deoarece parametrii săi sunt normalizați mai precis și, spre deosebire de uleiul de cedru, nu se usucă pe suprafața lentilei frontale a obiectivului. Pentru lentilele care operează în regiunea ultravioletă a spectrului, glicerolul este utilizat ca lichid de imersie. În niciun caz nu trebuie să folosiți înlocuitori pentru uleiul de imersie și, în special, uleiul de vaselină.
**Imaginea obtinuta cu lentile prezinta diverse neajunsuri: aberatii sferice si cromatice, curbura campului imaginii etc. La lentilele formate din mai multe lentile, aceste neajunsuri sunt intr-o oarecare masura corectate. În funcție de gradul de corectare a acestor neajunsuri, se disting lentilele acromatice și lentilele apocromatice mai complexe. În consecință, lentilele în care curbura câmpului imaginii este corectată sunt numite acromate plan și apocromate plan. Utilizarea acestor lentile produce o imagine clară pe întregul câmp, în timp ce imaginea obținută cu lentile convenționale nu are aceeași claritate în centru și la marginile câmpului vizual. Toate caracteristicile obiectivului sunt de obicei gravate pe rama acestuia: mărire proprie, deschidere, tip de lentilă (APO - apocromat etc.); Lentilele cu imersie în apă au denumirea VI și un inel alb în jurul cadrului în partea inferioară, lentilele cu imersie în ulei au denumirea MI și un inel negru.
Toate obiectivele sunt proiectate să funcționeze cu o lamelă de acoperire de 0,17 mm.
Grosimea lamei afectează în special calitatea imaginii atunci când lucrați cu sisteme uscate puternice (40x). Atunci când lucrați cu obiective de imersie, nu trebuie utilizate lame de acoperire mai groase de 0,17 mm, deoarece grosimea lamei de acoperire poate fi mai mare decât distanța de lucru a obiectivului și, în acest caz, atunci când se încearcă focalizarea obiectivului pe specimen, lentila frontală a obiectivului poate fi deteriorată.
Ocularele constau din două lentile și vin și în mai multe tipuri, fiecare dintre ele fiind folosită cu un anumit tip de lentilă, eliminând și mai mult imperfecțiunile imaginii. Tipul de ocular și mărirea acestuia sunt marcate pe rama acestuia.
Condensatorul este conceput pentru a focaliza lumina de la iluminator asupra preparatului, îndreptată de oglinda microscopului sau iluminatorului (în cazul utilizării unui iluminator atașat sau încorporat). Unul dintre detaliile condensatorului este diafragma de deschidere, care este esențială pentru iluminarea corectă a specimenului.
Iluminatorul constă dintr-o lampă cu incandescență de joasă tensiune cu un filament gros, un transformator, o lentilă colectoare și o diafragmă de câmp, a cărei deschidere determină diametrul câmpului iluminat pe specimen. Oglinda direcționează lumina de la iluminator în condensator. Pentru a menține paralelismul fasciculelor care vin de la iluminator la condensator, este necesar să folosiți doar partea plată a oglinzii.

Setarea iluminării și focalizării microscopului

Calitatea imaginii depinde, de asemenea, în mare măsură de iluminarea adecvată. Există mai multe moduri diferite de a ilumina un specimen la microscopie. Cea mai comună cale este instalatii de iluminat conform Köhler, care este după cum urmează:
1) așezați iluminatorul pe oglinda microscopului;
2) aprindeți lampa de iluminare și direcționați lumina către o oglindă plată (!) pentru microscop;
3) aşezaţi preparatul pe platoul microscopului;
4) acoperiți oglinda microscopului cu o foaie de hârtie albă și focalizați imaginea filamentului lămpii pe aceasta prin mișcarea soclului lămpii în iluminator;
5) scoateți o coală de hârtie din oglindă;
6) închideți diafragma de deschidere a condensatorului. Mișcând oglinda și mișcând ușor soclul lămpii, imaginea filamentului este focalizată pe diafragma de deschidere. Distanța iluminatorului de la microscop trebuie să fie astfel încât imaginea filamentului lămpii să fie egală cu diametrul diafragmei de deschidere a condensatorului (diafragma de deschidere poate fi observată folosind o oglindă plată plasată în partea dreaptă a bazei microscopului ).
7) deschideți diafragma de deschidere a condensatorului, reduceți deschiderea diafragmei de câmp a iluminatorului și reduceți semnificativ incandescența lămpii;
8) la mărire mică (10x), privind în ocular, se obține o imagine clară a preparatului;
9) rotind ușor oglinda, imaginea diafragmei de câmp, care arată ca un punct luminos, este transferată în centrul câmpului vizual. Coborând și ridicând condensatorul, se realizează o imagine clară a marginilor diafragmei de câmp în planul preparatului (în jurul lor se vede o margine colorată);
10) deschideți diafragma de câmp a iluminatorului la marginile câmpului vizual, creșteți incandescența filamentului lămpii și reduceți ușor (cu 1/3) deschiderea diafragmei de deschidere a condensatorului;
11) Când schimbați lentila, trebuie să verificați setarea luminii.
După finalizarea ajustării luminii conform lui Koehler, este imposibil să se schimbe poziția condensatorului și deschiderea diafragmelor de câmp și deschidere. Iluminarea preparatului poate fi reglată numai cu filtre neutre de lumină sau prin schimbarea incandescenței lămpii cu ajutorul unui reostat. Deschiderea excesivă a diafragmei de deschidere a condensatorului poate duce la o scădere semnificativă a contrastului imaginii, iar deschiderea insuficientă poate duce la o deteriorare semnificativă a calității imaginii (apariția inelelor de difracție). Pentru a verifica deschiderea corectă a diafragmei de deschidere, este necesar să scoateți ocularul și, privind în tub, să îl deschideți astfel încât să acopere câmpul luminos cu o treime. Pentru iluminarea corectă a preparatului, atunci când lucrați cu lentile cu mărire redusă (până la 10x), este necesar să deșurubați și să îndepărtați lentila superioară a condensatorului.
Atenţie! Când lucrați cu lentile care oferă o mărire mare - cu sisteme puternic uscate (40x) și imersiune (90x), pentru a nu deteriora lentila frontală, la focalizare se folosește următoarea tehnică: observând din lateral, coborâți lentila cu un macro surub aproape pana vine in contact cu preparatul, apoi, privind in ocular, macrosurubul ridica foarte incet lentila pana apare imaginea, iar cu ajutorul microsurubului se realizeaza focalizarea finala a microscopului.

Îngrijirea microscopului

Când lucrați cu un microscop, nu faceți eforturi mari. Nu atingeți suprafețele lentilelor, oglinzilor și filtrelor cu degetele.
Pentru a proteja suprafețele interne ale obiectivelor, precum și prismele tubului de praf, trebuie să lăsați întotdeauna ocularul în tub. Când curățați suprafețele exterioare ale lentilelor, îndepărtați praful de pe acestea cu o perie moale spălată în eter. Dacă este necesar, ștergeți cu atenție suprafețele lentilelor cu o lenjerie bine spălată, fără săpun sau o cârpă cambrică ușor umezită cu benzină curată, eter sau un amestec special pentru curățarea opticii. Nu este recomandat să ștergeți lentilele optice cu xilen, deoarece acest lucru le poate face să se lipească.
De la oglinzile cu argint exterior, puteți îndepărta praful doar suflându-l cu un bec de cauciuc. Nu le poți șterge. De asemenea, este imposibil să deșurubați și să dezasamblați singur lentilele - acest lucru va duce la deteriorarea acestora. După terminarea lucrărilor la microscop, este necesar să îndepărtați cu atenție resturile de ulei de imersie de pe lentila frontală a obiectivului în modul descris mai sus. Apoi coborâți scena (sau condensatorul în microscoape cu plată fixă) și acoperiți microscopul cu un capac.
Pentru a păstra aspectul microscopului, este necesar să-l ștergeți periodic cu o cârpă moale ușor înmuiată în vaselină fără acid și apoi cu o cârpă uscată, moale și curată.

În plus față de microscopia ușoară convențională, există metode de microscopie care vă permit să studiați microorganismele necolorate: contrast de fază , câmp întunecatși luminescent microscopie. Pentru a studia microorganismele și structurile lor, a căror dimensiune este mai mică decât rezoluția unui microscop ușor, utilizați

Mărirea sistemului- un factor important, care se bazează pe alegerea unuia sau altuia microscop, în funcție de rezolvarea sarcinilor necesare. Cu toții suntem obișnuiți cu faptul că este necesar să controlăm elementele semiconductoare pe un microscop de inspecție cu o mărire de 1000x sau mai mult, puteți studia insectele lucrând cu un stereomicroscop de 50x și am studiat solzii de ceapă pătați cu iod sau verde strălucitor la școală la un microscop monocular, când conceptul de mărire nu ne era încă familiar.

Dar cum să interpretăm conceptul de mărire atunci când avem un microscop digital sau confocal în fața noastră, iar valorile de 2000x, 5000x sunt pe obiective? Ce înseamnă, mărirea de 1000x pe un microscop optic va produce o imagine similară cu un microscop digital de 1000x? Veți afla despre asta în acest articol.

Sistem de zoom optic

Când lucrăm cu un microscop de laborator sau stereoscopic, nu este dificil să calculăm mărirea curentă a sistemului. Este necesar să se înmulțească mărirea tuturor componentelor optice ale sistemului. De obicei, în cazul unui microscop stereo, acesta este un obiectiv, zoom sau tambur de mărire și oculare.
In cazul unui microscop conventional de laborator, situatia este si mai simpla - marirea totala a sistemului = marirea ocularelor inmultita cu marirea lentilei instalate in pozitia de lucru. Este important de reținut că uneori există modele specifice de tuburi de microscop care au un factor de creștere sau scădere (în special pentru modelele mai vechi de microscoape Leitz). De asemenea, componente optice suplimentare, fie că este vorba despre o sursă de iluminare coaxială într-un microscop stereo sau un adaptor intermediar de cameră situat sub tub, pot avea un factor de mărire suplimentar.

De exemplu, un microscop stereo cu oculare de 10x, un obiectiv de 2x, un zoom la 8x și o unitate de iluminare coaxială cu un factor de 1,5x va avea o mărire optică totală de 10x2x8x1,5 = 240x.

În acest caz, mărirea optică (G) ar trebui înțeleasă ca raportul dintre tangentei unghiului de înclinare a fasciculului care a ieșit din sistemul optic în spațiul imaginii și tangentei unghiului fasciculului conjugat la acesta în spațiu al obiectelor. Sau raportul dintre lungimea segmentului format de sistemul optic al imaginii, perpendicular pe axa sistemului optic, la lungimea segmentului în sine

Creșterea geometrică a sistemului

În cazul în care sistemul nu are oculare, iar imaginea mărită este formată de camera de pe ecranul monitorului, de exemplu, ca la microscop, ar trebui să trecem la termenul de mărire geometrică a sistemului optic.
Mărirea geometrică a microscopului este raportul dintre dimensiunea liniară a imaginii obiectului de pe monitor și dimensiunea reală a obiectului studiat.
Puteți obține valoarea măririi geometrice înmulțind următoarele valori: zoom-ul optic al obiectivului, zoom-ul optic al adaptorului camerei, raportul dintre diagonala monitorului și diagonala matricei camerei.
De exemplu, când lucrăm la un microscop de laborator cu un obiectiv de 50x, un adaptor de cameră de 0,5x, o cameră de 1/2,5” și afișând imaginea pe un monitor de laptop de 14”, vom obține o mărire geometrică a sistemului = 50x0,5x (14/0,4) = 875x.
Deși mărirea optică în acest caz va fi egală cu 500x în cazul ocularelor de 10x.

Microscoapele digitale, profilometrele confocale, microscoapele electronice și alte sisteme care formează o imagine digitală a unui obiect pe ecranul monitorului funcționează cu conceptul de mărire geometrică. Nu confunda acest concept cu zoom optic.

Rezoluția microscopului

Există o concepție greșită larg răspândită că rezoluția unui microscop și mărirea acestuia sunt interconectate printr-o relație rigidă - cu cât mărirea este mai mare, cu atât obiectele mai mici putem vedea în el. Nu este adevarat. Cel mai important factor este întotdeauna permisiune sistem optic. La urma urmei, o creștere a unei imagini nerezolvate nu ne va oferi informații noi despre aceasta.

Rezoluția unui microscop depinde de valoarea numerică a deschiderii obiectivului, precum și de lungimea de undă a sursei de lumină. După cum puteți vedea, nu există niciun parametru de creștere a sistemului în această formulă.

unde λ este lungimea medie de undă a sursei de lumină, NA este deschiderea numerică a obiectivului, R este rezoluția sistemului optic.

Când se folosește un obiectiv cu NA 0,95 pe un microscop de laborator cu o sursă de halogen (lungime de undă medie de aproximativ 500 nm), obținem o rezoluție de aproximativ 300 nm.

După cum se poate observa din conceptul de microscop cu lumină, ocularele măresc imaginea reală a unui obiect. Dacă, de exemplu, creștem mărirea ocularelor de 2 ori (introduceți oculare de 20x în microscop), atunci mărirea totală a sistemului se va dubla, dar rezoluția va rămâne aceeași.

Notă importantă

Să presupunem că avem două opțiuni pentru construirea unui microscop simplu de laborator. Primul este construit folosind un obiectiv 40x NA 0,65 și oculare 10x. Al doilea va folosi un obiectiv 20x NA 0.4 cu oculare de 20x.

Mărirea microscoapelor în ambele versiuni va fi aceeași= 400x (înmulțirea simplă a măririi obiectivului și a ocularelor). Si aici rezoluția în prima opțiune va fi mai mare, decât în ​​al doilea, deoarece deschiderea numerică a obiectivului 40x este mai mare. În plus, nu uitați de câmpul vizual al ocularelor, în 20x acest parametru este cu 20-25% mai mic.

Calitatea imaginii determinat rezoluția microscopului, adică distanța minimă la care optica unui microscop poate distinge separat două puncte apropiate. rezoluția depinde de deschiderea numerică a obiectivului, de condensator și de lungimea de undă a luminii care luminează preparatul. Diafragma numerică (deschiderea) depinde de deschiderea unghiulară și de indicele de refracție al mediului situat între lentila frontală a obiectivului și condensator și preparat.

Diafragma lentilei unghiulare- acesta este unghiul maxim (AOB) la care razele care au trecut prin preparat pot intra in cristalin. Diafragma numerică a obiectivului este egal cu produsul dintre sinusul jumătății din deschiderea unghiulară și indicele de refracție al mediului situat între lama de sticlă și lentila frontală a obiectivului. N / A. = n sinα unde, N.A. - deschidere numerică; n este indicele de refracție al mediului dintre preparat și obiectiv; sinα - sinusul unghiului α egal cu jumătate din unghiul AOB din diagramă.

Astfel, deschiderea sistemelor uscate (între lentila frontală a obiectivului și aerul de pregătire) nu poate fi mai mare de 1 (de obicei nu mai mult de 0,95). Mediul plasat între preparat și obiectiv se numește lichid de imersie sau imersie, iar lentila proiectată să funcționeze cu lichid de imersie se numește imersie. Datorită imersiunii cu un indice de refracție mai mare decât aerul, este posibilă creșterea deschiderii numerice a obiectivului și deci a puterii de rezoluție.

Diafragma numerică a obiectivelor este întotdeauna gravată pe ramele acestora.
Rezoluția microscopului depinde și de deschiderea condensatorului. Dacă luăm în considerare deschiderea condensatorului egală cu deschiderea lentilei, atunci formula rezoluției este R=λ/2NA, unde R este limita rezoluției; λ - lungimea de undă; N.A - deschidere numerică. Din această formulă se poate observa că atunci când este observată în lumină vizibilă (partea verde a spectrului - λ=550nm), rezoluția (limita de rezoluție) nu poate fi > 0,2 µm

Efectul diafragmei numerice a unui obiectiv de microscop asupra calității imaginii

Modalități de îmbunătățire a rezoluției optice

Selectarea unghiului conului de lumină ridicat, atât pe partea lentilei, cât și pe partea sursei de lumină. Datorită acestui fapt, este posibilă colectarea mai multor raze de lumină refractată din structurile foarte subțiri din lentilă. Astfel, prima modalitate de a crește rezoluția este utilizarea unui condensator a cărui deschidere numerică se potrivește cu deschiderea numerică a obiectivului.

A doua modalitate este de a folosi un lichid de imersie între lentila frontală a obiectivului și lamelă. Deci se acționează asupra indicelui de refracție al mediului n, descris în prima formulă. Valoarea sa optimă recomandată pentru lichide de imersie este 1,51.

Lichide de imersie

Lichide de imersie sunt necesare pentru a mări deschiderea numerică și, în consecință, rezoluția obiectivelor de imersie special concepute pentru lucrul cu aceste lichide și marcate corespunzător. Lichidele de imersie plasate între obiectiv și preparat au un indice de refracție mai mare decât aerul. Prin urmare, razele de lumină deviate de cele mai mici detalii ale obiectului nu se împrăștie, părăsind preparatul, și intră în lentilă, ceea ce duce la o creștere a rezoluției.

Există lentile pentru imersie în apă (marcate cu un inel alb), imersie în ulei (inel negru), imersie în glicerină (inel galben), imersie monobromonaftalină (inel roșu). În microscopia cu lumină a preparatelor biologice se folosesc obiective de imersie în apă și ulei. Lentilele speciale de cuarț de imersie în glicerină transmit radiații ultraviolete cu undă scurtă și sunt concepute pentru microscopie ultravioletă (a nu se confunda cu luminiscentă) (adică pentru studiul obiectelor biologice care absorb selectiv razele ultraviolete). Obiectivele de imersie cu monobromonaftalină nu sunt utilizate în microscopia obiectelor biologice.

Apa distilată este folosită ca lichid de imersie pentru lentila de imersie în apă, uleiul natural (cedru) sau sintetic cu un anumit indice de refracție este utilizat pentru imersie în ulei.

Spre deosebire de alte lichide de imersie imersie în ulei este omogen deoarece are un indice de refracție egal sau foarte apropiat cu cel al sticlei. De obicei, acest indice de refracție (n) este calculat pentru o anumită linie spectrală și o anumită temperatură și este indicat pe sticla de ulei. Deci, de exemplu, indicele de refracție al uleiului de imersie pentru lucrul cu o sticlă de acoperire pentru linia spectrală D în spectrul de sodiu la o temperatură de = 20 ° C este 1,515 (nD 20 = 1,515), pentru a lucra fără un geam de acoperire ( nD20 = 1,520).

Pentru a lucra cu lentile apocromate, dispersia este, de asemenea, normalizată, adică diferența de indici de refracție pentru diferite linii ale spectrului.

Utilizarea uleiului sintetic de imersie este de preferat, deoarece parametrii săi sunt normalizați mai precis și, spre deosebire de uleiul de cedru, nu se usucă pe suprafața lentilei frontale a obiectivului.

Având în vedere cele de mai sus, în niciun caz nu trebuie să folosiți înlocuitori pentru uleiul de imersie și, în special, uleiul de vaselină. În unele tehnici de microscopie, pentru a mări deschiderea condensatorului, un lichid de imersie (de obicei apă distilată) este plasat între condensator și eșantion.

După cum știți, o persoană primește cea mai mare parte a informațiilor despre lumea din jurul său cu ajutorul viziunii. Ochiul uman este un instrument complex și perfect. Acest dispozitiv creat de natură funcționează cu lumină - radiație electromagnetică, al cărei interval de lungimi de undă este între 400 și 760 de nanometri. Culoarea pe care o percepe o persoană în același timp se schimbă de la violet la roșu.

Undele electromagnetice corespunzătoare luminii vizibile interacționează cu învelișurile de electroni ale atomilor și moleculelor ochiului. Rezultatul acestei interacțiuni depinde de starea electronilor acestor învelișuri. Lumina poate fi absorbită, reflectată sau împrăștiată. Ce s-a întâmplat exact cu lumina poate spune multe despre atomii și moleculele cu care a interacționat. Gama de dimensiuni a atomilor și moleculelor este de la 0,1 la zeci de nanometri. Aceasta este de multe ori mai mică decât lungimea de undă a luminii. Cu toate acestea, obiectele exact de această dimensiune - să le numim nano-obiecte - sunt foarte importante de văzut. Ce trebuie făcut pentru asta? Să discutăm mai întâi ce poate vedea ochiul uman.

De obicei, când se vorbește despre rezoluția unui dispozitiv optic, aceștia funcționează cu două concepte. Unul este rezoluția unghiulară, iar celălalt este rezoluția liniară. Aceste concepte sunt interconectate. De exemplu, pentru ochiul uman, rezoluția unghiulară este de aproximativ 1 minut de arc. În acest caz, ochiul poate distinge două obiecte punctuale care se află la 25–30 cm distanță de el numai atunci când distanța dintre aceste obiecte este mai mare de 0,075 mm. Aceasta este destul de comparabilă cu rezoluția unui scaner de computer convențional. Într-adevăr, o rezoluție de 600 dpi înseamnă că scanerul poate distinge punctele aflate la o distanță de 0,042 mm.

Pentru a putea distinge obiectele aflate la distanțe și mai mici unele de altele, a fost inventat un microscop optic - un dispozitiv care mărește rezoluția ochiului. Aceste dispozitive arată diferit (după cum se poate vedea din Figura 1), dar au același principiu de funcționare. Microscopul optic a făcut posibilă mutarea limitei de rezoluție până la fracții de micron. Deja cu 100 de ani în urmă, microscopia optică a făcut posibilă studierea obiectelor de dimensiunea micronului. Totuși, în același timp, a devenit clar că este imposibil să se obțină o creștere suplimentară a rezoluției prin simpla creștere a numărului de lentile și îmbunătățirea calității acestora. Rezoluția unui microscop optic s-a dovedit a fi limitată de proprietățile luminii în sine, și anume natura ondulatorie.

La sfârșitul secolului înainte de ultimul, s-a constatat că rezoluția unui microscop optic este de . În această formulă, λ este lungimea de undă a luminii și n păcat u- deschiderea numerică a obiectivului microscopului, care caracterizează atât microscopul, cât și substanța care se află între obiectul de studiu și lentila microscopului cea mai apropiată de acesta. Într-adevăr, expresia pentru deschiderea numerică include indicele de refracție n mediul dintre obiect și lentilă și unghiul uîntre axa optică a lentilei și razele cele mai exterioare care ies din obiect și pot pătrunde în această lentilă. Indicele de refracție al vidului este egal cu unitatea. Pentru aer, acest indicator este foarte aproape de unitate, pentru apă este 1,33303, iar pentru lichidele speciale utilizate în microscopie pentru a obține rezoluția maximă, n ajunge la 1,78. Oricare ar fi unghiul u, păcat u nu poate fi mai mare de unu. Astfel, rezoluția unui microscop optic nu depășește o fracțiune din lungimea de undă a luminii.

Rezoluția este de obicei considerată a fi jumătate din lungimea de undă.

Intensitatea, rezoluția și mărirea unui obiect sunt două lucruri diferite. Puteți face astfel încât distanța dintre centrele imaginii obiectelor aflate la o distanță de 10 nm să fie de 1 mm. Aceasta ar corespunde unei măriri de 100.000 de ori. Cu toate acestea, nu va fi posibil să distingem dacă acesta este un obiect sau două. Cert este că imaginile obiectelor, ale căror dimensiuni sunt foarte mici în comparație cu lungimea de undă a luminii, vor avea aceeași formă și dimensiune, independent de forma obiectelor în sine. Astfel de obiecte se numesc obiecte punctuale - dimensiunile lor pot fi neglijate. Dacă un astfel de obiect punctual strălucește, atunci un microscop optic îl va reprezenta ca un cerc de lumină înconjurat de inele deschise și întunecate. Mai departe, pentru simplitate, luăm în considerare sursele de lumină. O imagine tipică a unei surse punctiforme de lumină, obținută cu ajutorul unui microscop optic, este prezentată în Figura 2. Intensitatea inelelor de lumină este mult mai mică decât cea a cercului și scade odată cu distanța de la centrul imaginii. Cel mai adesea, doar primul inel luminos este vizibil. Diametrul primului inel întunecat este de . Funcția care descrie o astfel de distribuție a intensității se numește funcție de împrăștiere a punctelor. Această funcție este independentă de mărirea. Imaginea mai multor obiecte punctuale va fi exact cercuri și inele, așa cum se poate vedea din Figura 3. Imaginea rezultată poate fi mărită, totuși, dacă imaginile a două obiecte punctiforme adiacente se îmbină, acestea se vor îmbina în continuare. O astfel de creștere este adesea numită inutilă - imaginile mari vor fi pur și simplu mai neclare. Un exemplu de mărire inutilă este prezentat în figura 4. Formula este adesea numită limită de difracție și este atât de faimoasă încât a fost sculptată pe monumentul autorului acestei formule, fizicianul optic german Ernst Abbe.

Desigur, de-a lungul timpului, microscoapele optice au început să fie echipate cu o varietate de dispozitive care vă permit să stocați imagini. Ochiul uman a fost completat mai întâi cu camere cu film și camere cu film, iar apoi cu camere bazate pe dispozitive digitale care convertesc lumina care le lovește în semnale electrice. Cele mai comune dintre aceste dispozitive sunt CCD-urile (CCD înseamnă dispozitiv cuplat cu încărcare). Numărul de pixeli din camerele digitale continuă să crească, dar acest lucru singur nu poate îmbunătăți rezoluția microscoapelor optice.

În urmă cu douăzeci și cinci de ani, părea că limita de difracție era de nedepășit și că pentru a studia obiectele ale căror dimensiuni sunt de multe ori mai mici decât lungimea de undă a luminii, era necesar să se abandoneze lumina ca atare. Acesta este modul în care au mers creatorii microscoapelor electronice și cu raze X. În ciuda numeroaselor avantaje ale unor astfel de microscoape, problema utilizării luminii pentru vizualizarea nanoobiectelor a rămas. Au existat multe motive pentru aceasta: comoditatea și ușurința de a lucra cu obiecte, timpul scurt necesar pentru a obține o imagine, metode cunoscute de colorare a probelor și multe altele. În cele din urmă, după mulți ani de muncă grea, a devenit posibilă vizualizarea nano-obiectelor cu un microscop optic. Cel mai mare progres în această direcție a fost realizat în domeniul microscopiei cu luminiscență. Desigur, nimeni nu a anulat limita de difracție, dar a fost posibil să o ocolească. În prezent, există diverse microscoape optice care vă permit să vizualizați obiecte care sunt mult mai mici decât lungimea de undă a luminii care creează imagini ale acestor obiecte. Toate aceste dispozitive au un principiu comun. Să încercăm să explicăm care dintre ele.

Din ceea ce s-a spus deja despre limita de difracție a rezoluției, este clar că nu este atât de dificil să vezi o sursă punctuală. Dacă această sursă are o intensitate suficientă, imaginea ei va fi clar vizibilă. Forma și dimensiunea acestei imagini, așa cum sa menționat deja, vor fi determinate de proprietățile sistemului optic. În același timp, cunoscând proprietățile sistemului optic și fiind sigur că obiectul este punct, este posibil să se determine exact unde se află obiectul. Precizia determinării coordonatelor unui astfel de obiect este destul de mare. Ca ilustrare poate servi figura 5. Coordonatele unui obiect punctual pot fi determinate cu cât mai precis, cu atât strălucește mai intens. În anii 80 ai secolului trecut, folosind un microscop optic, ei au putut determina poziția moleculelor luminoase individuale cu o precizie de 10-20 nanometri. O condiție necesară pentru o determinare atât de precisă a coordonatelor unei surse punctuale este singurătatea acesteia. O altă sursă punctuală cea mai apropiată ar trebui să fie atât de departe încât cercetătorul să știe sigur că imaginea procesată corespunde unei singure surse. Este clar că această distanță l trebuie să îndeplinească condiția. În acest caz, analiza imaginii poate oferi date foarte precise despre poziția sursei în sine.

Majoritatea obiectelor ale căror dimensiuni sunt mult mai mici decât rezoluția unui microscop optic pot fi reprezentate ca un set de surse punctuale. Sursele de lumină dintr-un astfel de set sunt situate la distanțe unele de altele mult mai mici decât . Dacă aceste surse strălucesc simultan, atunci va fi imposibil să spunem ceva despre exact locul în care se află. Cu toate acestea, dacă puteți face aceste surse să strălucească pe rând, atunci poziția fiecăreia dintre ele poate fi determinată cu mare precizie. Dacă această precizie depășește distanța dintre surse, atunci, cunoscând poziția fiecăreia dintre ele, puteți afla care este poziția lor relativă. Și asta înseamnă că au fost obținute informații despre forma și dimensiunea obiectului, care sunt prezentate ca un set de surse punctuale. Cu alte cuvinte, în acest caz, se poate lua în considerare un obiect cu un microscop optic ale cărui dimensiuni sunt mai mici decât limita de difracție!

Astfel, punctul cheie este obținerea de informații despre diferite părți ale nanoobiectului independent unul de celălalt. Există trei grupuri principale de metode pentru a face acest lucru.

Primul grup de metode face intenționat să strălucească una sau alta parte a obiectului studiat. Cea mai cunoscută dintre aceste metode este microscopia optică cu scanare în câmp apropiat. Să o luăm în considerare mai detaliat.

Dacă se examinează cu atenție condițiile care sunt implicate atunci când se vorbește despre limita de difracție, se va constata că distanțele de la obiecte la lentile sunt mult mai mari decât lungimea de undă a luminii. La distanțe comparabile sau mai mici decât această lungime de undă, imaginea este diferită. În apropierea oricărui obiect care a căzut în câmpul electromagnetic al unei unde luminoase, există un câmp electromagnetic alternativ, a cărui frecvență este aceeași cu frecvența câmpului în unda luminoasă. Spre deosebire de unda luminoasă, acest câmp se degradează rapid odată cu distanța de la nanoobiect. Distanța pe care intensitatea scade, de ex. e ori comparabil cu dimensiunea obiectului. Astfel, câmpul electromagnetic de frecvență optică este concentrat într-un volum de spațiu, a cărui dimensiune este mult mai mică decât lungimea de undă a luminii. Orice nano-obiect care intră în această zonă va interacționa cumva cu câmpul concentrat. Dacă obiectul cu care se realizează această concentrare a câmpului este deplasat succesiv de-a lungul unei traiectorii de-a lungul nanoobiectului studiat și este înregistrată lumina emisă de acest sistem, atunci se poate construi o imagine din puncte individuale situate pe această traiectorie. Desigur, în fiecare punct imaginea va arăta așa cum se arată în Figura 2, dar rezoluția va fi determinată de cât de mult a fost concentrat câmpul. Și aceasta, la rândul său, este determinată de dimensiunea obiectului cu care este concentrat acest câmp.

Cel mai obișnuit mod de a concentra câmpul în acest fel este de a face o gaură foarte mică în ecranul metalic. De obicei, această gaură este situată la capătul unui ghidaj de lumină ascuțit, acoperit cu metal (un ghid de lumină este adesea numit fibră optică și este utilizat pe scară largă pentru transmisia de date pe distanțe lungi). Acum este posibil să se producă găuri cu diametre de la 30 la 100 nm. Rezoluția este aceeași. Dispozitivele care funcționează pe acest principiu se numesc microscoape optice cu scanare în câmp apropiat. Au apărut acum 25 de ani.

Esența celui de-al doilea grup de metode este următoarea. În loc să faceți nano-obiectele învecinate să strălucească la rândul lor, puteți utiliza obiecte care strălucesc în culori diferite. În acest caz, cu ajutorul filtrelor de lumină care transmit lumină de o culoare sau alta, este posibil să se determine poziția fiecăruia dintre obiecte, iar apoi să se compună o singură imagine. Acest lucru este foarte asemănător cu ceea ce este arătat în Figura 5, doar culorile pentru cele trei imagini vor fi diferite.

Ultimul grup de metode care fac posibilă depășirea limitei de difracție și examinarea nanoobiectelor utilizează proprietățile obiectelor luminoase în sine. Există surse care pot fi „pornite” și „oprite” cu ajutorul luminii special selectate. O astfel de schimbare are loc statistic. Cu alte cuvinte, dacă există multe nano-obiecte comutabile, atunci, alegând lungimea de undă a luminii și intensitatea acesteia, este posibil să se „stingă” doar o parte din aceste obiecte. Obiectele rămase vor continua să strălucească și puteți obține o imagine de la ele. După aceea, trebuie să „porniți” toate sursele și din nou să „dezactivați” unele dintre ele. Setul de surse care rămân „pornit” va fi diferit de setul care a fost lăsat „pornit” prima dată. Repetând această procedură de mai multe ori, puteți obține un set mare de imagini care diferă unele de altele. Analizând o astfel de mulțime, este posibil să se localizeze o mare parte din toate sursele cu o precizie foarte mare, cu mult peste limita de difracție. Un exemplu de super rezoluție obținută în acest mod este prezentat în Figura 6.

În prezent, microscopia optică de super-rezoluție se dezvoltă rapid. Este sigur să presupunem că în următorii ani acest domeniu va atrage un număr tot mai mare de cercetători și aș dori să cred că cititorii acestui articol se vor număra printre ei.